چشم انداز برنج C4
ایده تبدیل برنج از یک گیاه C3 به یک گیاه C4، مستلزم انتقال ویژگیهای آناتومیکی و بیوشیمیایی مرتبط با فتوسنتز C4 به برنج است. این امر شامل موارد زیر میشود:
تغییر در ساختار برگ برنج
ایجاد سلولهای تخصصیافته غلاف آوند (bundle sheath) با دیوارههای ضخیم و غنی از کلروپلاست، بهگونهای که بتوانند بهعنوان محفظهای برای چرخه کالوین عمل کنند.
مهندسی آنزیمی برنج
القای و بیان آنزیمهای کلیدی فتوسنتز C4، از جمله فسفوانولپیروات کربوکسیلاز (PEPC) و پیرووات، اُرتو فسفات دیکیناز (PPDK)، تا تثبیت اولیه کربن در سلولهای مزانفیل بهصورت کارآمد انجام شود.
معرفی مکانیسمهای تنظیمی برنج
هماهنگی دقیق در بیان ژنهای مرتبط با فتوسنتز C4 (هم در سطح رونویسی و هم در سطح پساترجمهای)، بهگونهای که این ژنها در بافتهای مناسب (مثلاً مزانفیل یا غلاف آوند) و در زمان درست فعال شده و یکپارچگی عملکردیِ کاملی در سیستم فتوسنتزی برنج ایجاد کنند.
این تغییرات جامع، مستلزم بازطراحی عمیق مسیرهای متابولیکی و سازماندهی مجدد ساختارهای سلولی در برنج است و تنها با رویکردهای چندرشتهای از جمله زیستشناسی، ژنتیک مولکولی، و مهندسی ژنوم قابل دستیابی خواهد بود.
برگ اندام اصلی فتوسنتز در گیاهان است. در طی رشد برگ، رگها بهصورت منظم الگوسازی شده و شبکهای برای انتقال آب و مواد مغذی تشکیل میدهند. این رگها بر اساس عرضشان به رُتبههای مختلفی تقسیم میشوند: رگهای اولیه شامل رگ مرکزی و رگهای ثانویه (یعنی رگهای رُتبه ۱ و ۲) میشوند؛ درحالیکه رگهای فرعی، شامل رگهای رُتبه ۳ یا رُتبههای بالاتر هستند. در محصولات C4 تکلپهای، رگ مرکزی در سراسر طول برگ کشیده شده و علاوه بر حمایت مکانیکی از برگ، وظیفه انتقال آب را نیز بر عهده دارد. همچنین رگهای ثانویه و رگهای فرعی با رُتبههای بالاتری وجود دارند که بهصورت طولی در برگ پراکنده شدهاند. کوچکترین رگهای فرعی، رگهای طولی مجاور را بهفاصلههای مساوی به هم متصل میکنند یا یک انتهای آنها آزادانه در بافت زمینه خاتمه مییابد. رگهای فرعی بیشترین سهم را از مجموع رگهای برگ تشکیل میدهند.
مقدار و عرض رگهای برگ (قطر، تراکم و فاصله بین رگها) تعیینکننده کارکردهای فیزیولوژیکی برگ هستند؛ از جمله کارایی آن در انجام فتوسنتز، نرخ بهرهبرداری از آب و کارایی تبادل گازی. کارکرد ویژه رگها در گیاهان C4، حفظ نرخ مناسبی از فتوسنتز C4 بهویژه تضمین کارایی چرخه C4 است شناخته شده است که فاصله بین رگها در برگهای C4 نسبت به برگهای C3 کاهش یافته و تراکم رگها افزایش مییابد. با این حال، تفاوت عمدهتر میان برگهای C4 و C3، افزایش قابل توجه تراکم رگهای فرعی در برگهای C4 است که برای چرخه C4 حیاتی میباشد.
در برگهای C4، سلولهای غلاف آوند (BS) نقش کلیدی در جذب نور دارند و علاوه بر این، کاهش کربن عمدتاً در این سلولها انجام میشود. در مقایسه با سلولهای مزانفیل (MS) ، افزایش تعداد سلولهای BS برای دستیابی به کارایی بالاتر فتوسنتز مطلوب است. بنابراین، کاهش فاصله بین رگها در برگهای C4 نسبت به برگهای C3 به ایجاد تعداد و حجم بالایی از سلولهای BS کمک کرده و همزمان فضای اشغالشده توسط سلولهای MS و سایر سلولهای غیرجاذب نور را کاهش میدهد. در نهایت، تعداد سلولهای MS در برگهای C4 نسبت به سلولهای BS کمتر است که این امر فاصله انتشار متابولیتهای واسطه C4 میان سلولهای MS و BS را کوتاه کرده و درنتیجه، کارایی فتوسنتز را افزایش میدهد.
همچنین، رگهای برگ در القای تمایز سلولهای مجاور در طی رشد برگ نقشی حیاتی ایفا میکنند. ازآنجاکه سلولهای غلاف آوند (BS) و سلولهای مزانفیل (MS) بهصورت مکانی خاص توزیع شدهاند و ژنهای نشانگر C4 در برگهای C4 بهصورت سلول-اختصاصی بیان میشوند، فرض میشود که رگهای برگ C4 سیگنالهایی را به سلولهای مجاور ارسال کرده و در نتیجه تمایز خاص سلولهای BS و MS را القا میکنند؛ در این فرآیند، سلولهای واقع در مجاورت رگها پیش از سلولهایی که فاصله بیشتری از رگها دارند، شروع به تمایز میکنند. شواهدی که از این فرضیه حمایت میکنند، حاکی از آن است که رشد انواع مختلف بافتهای فتوسنتزی از نظر مکانی و زمانی وابسته است. بهعنوان مثال، در پوسته ذرت، تنها سلولهای مزانفیل مجاور سلولهای غلاف آوند دارای ویژگیهای بیوشیمیایی C4 هستند، درحالیکه سلولهای مزانفیلی که فاصله بیشتری از سلولهای غلاف آوند دارند، بیشتر به ویژگیهای بیوشیمیایی مشخصه C3 گرایش دارند.
افزایش تراکم رگهای برگ، بهعنوان یک ویژگی پیشنیاز برای بهبود فتوسنتز برگ برنج در نظر گرفته میشود؛ زیرا این امر با بهینهسازی نسبت و نزدیکی میان سلولهای غلاف آوند (BS) و سلولهای مزانفیل (MS) و تسهیل انتقال سریع متابولیتهای واسطه فتوسنتزی، زمینه لازم را برای اجرای مؤثر و موفق مهندسی برنج C4 فراهم میآورد فلدمن و همکاران (۲۰۱۴) با غربالگری جهشیافتههای حذفی برنج (رقمIR64)) و T-DNA رقم (Tainung 67)، موفق به شناسایی هشت خط جهشیافته (E11068-1-10، E19076-1-5، G558-11-5، E22097-1-3، E26181-1-1، M0104656-B، M0105588-A و M0110124-A) با فاصله بین رگهای (IVD) بهطور چشمگیری کاهشیافته شدند. این جهشیافتهها میتوانند بهعنوان خطوط دریافتکننده مورد استفاده قرار گیرند که در آینده بتوان بیوشیمی C4 را در آنها القا کرد. علاوه بر این، کشف ارتباط فنوتیپی میان صفت کاهش فاصله بین رگها و صفت برگ باریک میتواند بهعنوان یک نشانگر فنوتیپی برای تسریع روشهای غربالگری جهت یافتن ژنوتیپهای با تراکم بالای رگبرگبندی بهکار رود.
بهطور کلی، چندین ژن دخیل در الگوی رگبرگبندی برگ در جهشیافتهها و خطوط تراریخته برنج C3 و ذرت C4 شناسایی و مورد مطالعه قرار گرفتهاند. این مطالعات نشان دادهاند که مکانیسمهای پایه رشد آوندی شامل: انتقال و سیگنالینگ قطبی اُکسین، برهمکنشهای پروتئین-پروتئین، تعامل بین هورمونها، ارتباط پلاستید-هسته و غیره است. جهش ساده یا بیان فراوان یک ژن مرتبط با موقعیتیابی آوندی، احتمالاً برای ایجاد ویژگی اختصاصی C4یعنی تراکم بالای رگهادر برگ برنج کافی نخواهد بود، مگر اینکه اثرات منفی بر رشد طبیعی برگ ایجاد نکند. بنابراین، برای تأسیس یک سیستم رگبرگیِ واقعاً مشخصه C4 در برنج، دستکاری دقیقِ این ژنها یا عناصر cisتنظیمی آنها،جهت دستیابی به بیان مناسب از نظر زمانی و مکانی ضروری خواهد بود.
برای تأسیس یک پیکربندی عملکردی از ساختار کرانز در برنج، گام پیشنیاز، درک آناتومی و کارکردهای سلولهای غلاف آوند در گیاهان C3 است. بر این باورند که سلولهای غلاف آوند در گیاهان C3 نقشهای گوناگونی ایفا میکنند که شامل: حمایت مکانیکی برگ، ذخیرهسازی و انتقال آب، سنتز، ذخیرهسازی و انتقال کربوهیدراتها، جذب و انتقال نیتروژن و گوگرد، انتقال مواد معدنی، متابولیسم آنتیاکسیدانی و ترمیم حفرهزایی (cavitation) در شرایط تنش خشکی میشود (لیگُد، ۲۰۰۸؛ میاکه، ۲۰۱۶). مهمترین ویژگی مرتبط با مهندسی برنج C4، سنتز و انتقال فرآوردههای فتوسنتزی توسط سلولهای غلاف آوند است. ازآنجاکه پذیرفته شده است که نیاکان C3 در طول تکامل، از پیش شرایط لازم برای القای فتوسنتز C4 را داشتهاند. جالب است که در نظر گرفته شود آیا این ویژگیِ سلولهای غلاف آوند در گیاهان C3 میتواند برای فتوسنتز C4 بهعنوان یک گام حیاتی در مهندسی برنج C4 بازکاربرد شود.
آناتومی غلاف آوند در گیاهان C3، بهخوبی در جو مطالعه شده است. سه نوع سلول غلاف آوند در این گیاه شناسایی شدهاند: سلولهای نوع S، سلولهای نوع L و سلولهای ساختاری. سلولهای نوع S احتمالاً در انتقال مواد جذبشده از سلولهای مزانفیل (MS) و آپوپلاست به آبکش دخیل هستند، درحالیکه سلولهای نوع L چنین نقشی را ایفا نمیکنند، زیرا موقعیت آنها از انتقال مستقیم فتوآسیمیلات به غلاف آوندِ مِستوم (mestome sheath) پشتیبانی نمیکند. جالب اینکه، برگ بسیاری از گونههای گیاهان گرهدار دارای غلاف آوند گسترده شده یا مزانفیل پاراونیل (paraveinal mesophyll) است که بهعنوان بافتی واسطه، فتوآسیمیلات را از سلولهای مزانفیل به آبکش انتقال میدهد. مطالعات همچنین نشان دادهاند که سلولهای غلاف آوند جو، فتوسیستم II و فعالیت روبیسکو را در خود دارند، که این امر نشان میدهد این سلولها میتوانند هم واکنشهای وابسته به نور و هم چرخه کالوین را انجام دهند.
بر این باورند که عوامل اکولوژیکی مؤثر در تکامل فتوسنتز C4 شامل کاهش دیاکسیدکربن جو، دماهای بالا، افزایش یا کاهش وقایع خشکسالی و افزایش یا کاهش شوری است و گیاهان C3 بهصورت مستقل ۶۶ تا ۶۸ بار این انتقال را تجربه کردهاند. علیرغم تنوع موجود در آناتومی برگ و مسیرهای بیوشیمیایی، برخی ویژگیهای مشترک در تکامل از فتوسنتز C3 به C4 وجود دارند. این ویژگیها شامل افزایش تراکم رگهای برگ، بزرگتر شدن اندازه سلولهای غلاف آوند، تأسیس فتوتنفس دوسلولی و غیره میشوند. پیشنهاد شده است که تمایز رشدی سلولهای غلاف آوند در گیاهان C4 ابتدا توسط سیگنالهای موقعیتی القا شده و سپس در سلسله سلولی محدود میشود، زیرا تمایز سلولهای غلاف آوند و مزانفیل همراه با رشد رگهای برگ رخ میدهد. ازآنجاکه رگهای مرکزی ابتدا رشد میکنند، تمایز سلولهای اطراف رگ مرکزی پیش از سلولهای اطراف رگهای ثانویه و ثالثیه اتفاق میافتد که نشان میدهد اثرات موقعیتی ممکن است در تعیین هویت و رشد سلولهای غلاف آوند دخیل باشند.سپس، هنگامی که مراکز پروکامبیال در تمایز آوندی دخیل میشوند، تمایز سلولهای غلاف آوند در همان سلسله سلولی محدود میگردد.
غربالگری جهشها نتوانست ژن منفردی را شناسایی کند که عیب خاص آناتومی کرانز را ایجاد کند، که این امر نشان میدهد احتمالاً ژن اصلی منفردی مسئول تمایز کرانز وجود ندارد. بنابراین، رشد اختصاصی کرانز احتمالاً توسط چندین ژن تنظیم میشود. بهنظر میرسد رویکرد ژنتیک رو به جلو (forward genetics) برای مطالعه رشد و تمایز سلولهای غلاف آوند در گیاهان C4 کافی نیست. در این راستا، رویکردهای زیستشناسی سامانهای، مانند ترانسکریپتومیکس و پروتئومیکس، روشی جدید برای شناسایی ژنهای حیاتی در بازپیکربندی آناتومی کرانز فراهم میآورند. تاکنون آزمایشهای متعددی با این هدف انجام شده است، از جمله: مقایسه پروفایلهای بیان ژنی میان گونههای نزدیک C3 وC4 ، تحلیل سامانهای گرادیانهای رشد برگ در گیاهان C4 ،مقایسه پروفایلهای بیان ژنی در طول گرادیان رشد برگ میان محصولات C3 و C4 ، مقایسه ترانسکریپتومیک و پروتئومیک میان سلولهای غلاف آوند و مزانفیل و تحلیلهای آناتومیکی و ترانسکریپتومی مقایسهای میان فازهای C3 و C4 یک گونه واحد.
هزاران ژن با بیان تفاضلی شناسایی شدهاند که در فرآیندهای زیستی مختلفی دخیل هستند: متابولیسم C4، فتوتنفس، انتقال الکترون فتوسنتزی، چرخه کالوین-بنسون، زیستسازی و نگهداری کلروپلاست، سنتز پروتئین، متابولیسم اسیدهای آمینه، متابولیسم نشاسته، سنتز کوفاکتورها، متابولیسم نیتروژن، شوک حرارتی/تاشدگی پروتئین، مدیریت فلزات، متابولیسم لیپید، سنتز DNA، چرخه سلولی، تقسیم پلاستید، بازسازی کروماتین، انتقال الکترون میتوکندریایی، رشد رگها و غیره.
با این حال، برای القای یک سیستم C4 کارآمد در برنج، تغییر همزمان الگوی بیان هزاران ژن برنج،که همولوگ ژنهای شناساییشده از طریق ترانسکریپتومیکس و پروتئومیکس مقایسهای هستند، عملی نیست. بنابراین، گزینه منطقی برای مهندسی برنج C4، شناسایی برخی عوامل رونویسی کلیدی بهعنوان ژنهای اصلی است که بتوانند چندین مسیر متابولیکی یا فرآیند زیستی را همزمان تنظیم کنند. بازیکریِ یکپارچه این مسیرها و فرآیندها برای تأسیس ویژگیهای C4 در برنج حیاتی خواهد بود.
درک عمیق از عناصر cis که ویژگیهای C4 را القا میکنند نیز برای مهندسی برنج C4 بسیار مهم است. برای این منظور، تحلیل گسترده دینامیک ترانسکریپتوم در برگهای در حال رشد ذرت انجام شد تا عناصر cis در ژنهای همبیانشونده شناسایی و عوامل رونویسی متناظر آنها پیشبینی شوند. این مطالعات قطعاً سرعت شناسایی عوامل آناتومیک و ژنتیکی کلیدی مسئول ویژگیهای C4 را افزایش خواهد داد.
جهشهای ژنتیکی SCR و SHR در برگهای ذرت و Arabidopsis بهخوبی مورد مطالعه قرار گرفتهاند. در جهشهای SCR ذرت، لایههای اضافی سلولهای غلاف آوند در اطراف رگها، در مقایسه با ذرت وحشی، مشاهده شد. همچنین، سلولهای غلاف آوند در برگ جهشیافتهها تشکیل غیرطبیعی داشتند و برخی از آنها فاقد نشاسته بودند. این یافتهها نشان میدهند که اختلال در عملکرد SCR منجر به ناهنجاری ژنتیکی در رشد طبیعی غلاف آوند میشود. در Arabidopsis، با این حال، برگهای جهشیافته SCR تقریباً هیچ نقص آشکاری در ریختشناسی غلاف آوند نشان نمیدهند. جالب اینکه، در جهشهای دوتایی SCR و SCL23—که نزدیکترین ژن همخانواده به SCR است، غلافهای آوند بزرگتر، نامنظمتر از نظر شکل و بیشتر شبیه به مزانفیل بودند که نشان میدهد SCL23 و SCR بهصورت افزایشی در تعیین سرنوشت سلولی غلاف آوند عمل میکنند. یک مطالعه عمیق نشان داد که SCR در انتقال قند در سلولهای غلاف آوند مرتبط با آبکش دخیل است، درحالیکه SCL23 در انتقال مواد معدنی در سلولهای غلاف آوند مرتبط با چوب نقش دارد. که این امر نشان میدهد این دو همولوگ در طول رشد برگ و گیاه، نقشهای متنوعی ایفا میکنند.
برای تولید برنج C4، افزایش حجم کلروپلاستها در سلولهای غلاف آوند (BS) جهت ارتقای ظرفیت فتوسنتزی ضروری است. از این رو، ریختشناسی و تعداد کلروپلاستها در سلولهای مزانفیل (MS) و غلاف آوند گیاهان C3 و C4 بهطور جداگانه توجه ویژهای را در حوزه مهندسی C4 ب ه خود جلب کردهاند. در یک مطالعه بر روی تعداد و اندازه کلروپلاستها در سلولهای مزانفیل میان گونههای C3، C4 و میانی C3–C4 جنس Flaveria، روندی مشخص شد که شامل افزایش محتوای کلروپلاست و کاهش اندازه کلروپلاستها در سلولهای مزانفیل از گونههای C3 به C2، سپس به گونههای شبه-C4 و در نهایت به گونههای C4 بود. ویژگیهای این روند با افزایش میزان چرخه C4 همبستگی دارد. جالب اینکه، برخی ژنهای مسئول زیستسازی پلاستید، مانند FtsZ1، FtsZ2، DRP5B و PARC6احتمالاً بخشی از عوامل مسئول تفاوت در تعداد کلروپلاستهای سلول مزانفیل میان گیاهان C3 و C4 هستند.
از سوی دیگر، سلولهای غلاف آوند در گیاهان C4 حاوی کلروپلاستهایی با اندازه بسیار بزرگتر و تعداد بیشتری نسبت به گیاهان C3 هستند، درحالیکه در گیاهان C3 این سلولها عمدتاً حاوی واکوئل بزرگ هستند. همچنین، غشای تیلاکوئیدی در کلروپلاستهای گیاهان C3 بهصورت گِرانا (دسته) چیده شده است، درحالیکه در گیاهان C4 کلروپلاستها دو ریختی (دیمورفیک) هستند و ساختار آنها بسته به نوع سلول برگی که در آن قرار دارند متفاوت است: در سلولهای مزانفیل گیاهان C4، کلروپلاستها دارای تیلاکوئیدهای دستهای هستند، اما در سلولهای غلاف آوند گیاهان C4، تیلاکوئیدهای غیردستهای (غیر استکشده) اغلب مشاهده میشوند.
گزارش شده است که بیان مداوم ژنهای GOLDEN2-LIKE (GLK) ذرت در برنج، بهطور چشمگیری اندازه کلروپلاستها در سلولهای غلاف آوند را افزایش داده و در نتیجه برنج تراریخته به مرحله تکاملی «پیشکرانز»، مرحلهای در انتقال از C3 به C4 رسیده است. بنابراین، ژنهای GLK از ژنهای حیاتی برای تولید برنج C4 محسوب میشوند. پروتئینهای GLK احتمالاً تعادل بیان مجموعهای از ژنهای مرتبط با فتوسنتز را تنظیم میکنند تا جذب کربن به حداکثر برسد. پیشنهاد شده است که در شرایط نور ضعیف، بهدلیل کمبود ATP و معادلهای کاهنده، زنجیره انتقال الکترون فتوسنتزی (PET) در حالت اکسید شده قرار گرفته و سیگنالهای بازگشتی (retrograde) از کلروپلاست به هسته ارسال میشوند. در پاسخ، بیان ژنهای GLK افزایش یافته و رونویسی مجموعهای از ژنهای مرتبط با فتوسنتز، از جمله ژنهای جذب نور، انتقال الکترون و بیوسنتز کلروفیل تقویت میشود. در شرایط نور شدید، زنجیره PET بهطور بیشازحد کاهش مییابد، زیرا واکنش تثبیت کربن نمیتواند با فعالیت بیشازحد واکنش نوری هماهنگ شود؛ این امر سیگنال بازگشتی منفی را از کلروپلاست به هسته فعال میکند که منجر به کاهش بیان ژنهای GLK و در پی آن سرکوب تجمع رونویسهای مرتبط با فتوسنتز، مانند Lhcb و ژنهای مرتبط با کلروفیل میشود.
